Fundamentos de los Microbiomas

vellosidades intestinales con bacterias

Históricamente, la identificación de microorganismos dependía de métodos basados en cultivos. Este método tiene limitaciones significativas, que incluyen la incapacidad de cultivar todos los organismos del microbioma.1-3

No todos los microorganismos son viables en las condiciones in vitro asociadas con los métodos basados en cultivos.1

Los métodos moleculares de próxima generación utilizan secuencias de ADN bacteriano como indicadores de los organismos con el fin de identificar la taxonomía, la abundancia relativa y la función.1,4-6 A continuación, se describen los métodos que se utilizan con mayor frecuencia.

ícono de medición de microbiomas

Descripción general de los métodos que se utilizan comúnmente para la medición de microbiomas

 

 

Secuenciación del gen ARNr 16S, descrito en 7 pasos. Paso 1, Se obtienen las muestras de heces. Paso 2, Se extrae el ADN con cebadores. Paso 3, Se amplifica el gen ARNr 16S. Paso 4, Se comparan las secuencias con las bibliotecas de referencia. Paso 5, Secuenciación. Paso 6, Se purifica y secuencia los amplicones de PCR. Paso 7, Se agrupan la secuencias en Unidades taxonómicas operativas (OTU) y se asigna un linaje taxonómicos a cada OTU.
Secuenciación metagenómica de escopeta, descrito en 7 pasos. Paso 1, Se obtienen las muestras. Paso 2, Se extrae el ADN. Paso 3, Se separan y etiquetan las secuencias de ADN; se limplan las muestras. Paso 4, Se amplifica el ADN etiquetado con PCD y se agregan "codigos de barras" moleculares. Paso 5, Se purifica el ADN y se vuelve a armar en genomas completos o parciales or se "aislan" para identificar el origen. Paso 6, Se analiza el grupo de genes y se comparan las secuencias con las bibliotecas de referen
qPCR (incluido el utilizado para la evaluación del indice de disbiosis canini), descrito en 6 pasos. Paso 1, Se obtienen las muestras. Paso 2, Se purifica y aísla el ADN. Paso 3, El ADN se desnaturaliza. Paso 4, El cebador se aparea y extiende. Paso 5, Sintesis de ADN y detección de fluorescencia. Paso 6, Se analizan los datos.

Secuenciación del gen marcador basado en amplicones

El método utilizado con mayor frecuencia implica la secuenciación del gen de ARN ribosómico (ARNr) 16S, presente en todas las bacterias y arqueas, aunque no lo está en hongos ni en el reino animal, para generar un censo microbiano de la muestra.1,4,7 La identificación del micobioma sustituye a genes de ARNr 18S.7

El gen ARNr 16S está altamente conservado en todas las especies bacterianas e incluye regiones hipervariables que permiten la diferenciación.1 Este método permite la identificación de muchos microorganismos a partir de una muestra, incluidos los microorganismos que no se pueden cultivar satisfactoriamente.1 No obstante, esta técnica no distingue entre microorganismos vivos o muertos, transitorios o residentes, comensales o patogénicos, o resistentes o sensibles a los antibióticos.1

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

La PCR cuantitativa es un método rápido y asequible para cuantificar la taxonomía bacteriana específica de interés, y permite el desarrollo de intervalos de referencia. Con base en la qPCR para siete especies bacterianas, se ha desarrollado un Índice de disbiosis de la flora intestinal canina que permite rastrear los cambios en el microbioma en respuesta al tratamiento.3

Este enlace lo llevará a un artículo en inglés que no está disponible en español.

Descripción del "censo microbiano"

Las unidades taxonómicas operativas (OTU) son grupos de secuencias de ADN basadas en la similitud. Las secuencias representativas de cada OTU se comparan con las bases de datos de referencia para asignar la identificación de los microbios en el grupo.

La diversidad alfa y la diversidad beta indican la variedad de las especies en el microbioma. La diversidad alfa es una medida de la diversidad dentro de una muestra.1 La diversidad alfa tiene en cuenta la riqueza (la cantidad de especies/OTA y su distribución) y la uniformidad (la cantidad relativa de las diferentes OTU/especies y su distribución). La diversidad alfa se basa en algoritmos y se expresa comúnmente como un índice como el índice de Shannon o el índice de Simpson.1 La diversidad beta es una medida de la disparidad entre las muestras, con frecuencia representada como patrones de grupo. Los sistemas que se utilizan para calcular la diversidad beta incluyen Bray-Curtis y el sistema UniFrac ponderado y no ponderado.1

Ampliación desde el censo hasta la función

A medida que la investigación continúa, surgen dos preguntas principales con respecto a los microbiomas: ¿qué microbios están presentes y qué están haciendo? La identificación de los microorganismos presentes en el microbioma no ofrece información sobre su función.3,5 Es probable que ciertas funciones metabólicas y moleculares se realicen en más de un microbio, lo que da como resultado un ecosistema redundante para proporcionar flexibilidad y resistencia.3,8

Debido a esta redundancia, el análisis del microbioma basado en las especies microbianas presentes en la población no es suficiente para la detección de cambios funcionales en el microbioma. Aunque la cantidad relativa de los microbios puede o no verse alterada por una intervención o afección, el microbioma presente puede cambiar las actividades microbianas y el metabolismo para compensar; con el fin de detectar estos cambios, se necesitan procedimientos analíticos diferentes. 

Secuenciación metagenómica de escopeta

Los métodos de escopeta, denominados así porque no son específicos (no están previstos para detectar la presencia de un conjunto predeterminado de microbios), están ganando popularidad en el análisis del microbioma de mascotas. Estos métodos ofrecen la ventaja de secuenciar genes funcionales, en lugar de simplemente identificar la identificación bacteriana.3-5 No obstante, estos procesos requieren mayores cantidades de ADN de las muestras y son más costosos.3

La secuenciación de lectura prolongada facilita el armado de genomas completos, incluidos los genes que generalmente se pierden con una metagenómica de lectura abreviada y que ofrecen conocimientos biológicos adicionales.6

Metabolómica, proteómica y transcriptómica

Estos procesos miden la actividad funcional en un microbioma.4 Los enfoques metabolómicos se utilizan para determinar el perfil de metabolitos, generalmente caracterizados a través de procesos tales como la resonancia magnética nuclear, la espectroscopia, la espectroscopia de masas y la cromatografía líquida.7 Estos métodos investigan las vías reguladas por los microbios, como la producción de ácidos grasos de cadena corta, el metabolismo de los ácidos biliares, la producción de neurotransmisores y la producción de indol.3

Métodos adicionales para medir el microbioma: footnote 7. Metabonómica - Una variación de la metabolómica en la que se genera un perfil de metabolitos a partir de un sistema complejo. Metagenómica - Recopilación de genomas y genes de los miembros de un microbioma, obtiendos mediante la secuenciación de escopeta del ADN extraído de una muestra. Metaproteómica - Análisis de todo el componente proteíco de una muestra. Metataxonomía - Proseco que implica crear un árbol que muestre le relación entra todas las se

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  1. Belas, A., Marques, C. y Pomba, C. (2020). The gut microbiome and antimicrobial resistance in companion animals. En Duarte, A. y Lopes da Costa, L. (Eds.), Advances in Animal Health, Medicine and Production (1st ed.), pp. 233–245. Springer International Publishing
  2. Cunningham, M., Azcarate-Peril, M. A., Barnard, A., Benoit, V., Grimaldi, R., Guyonnet, D., Gibson, G. R. (2021). Shaping the future of probiotics and prebiotics. Trends in Microbiology, 29(8), 667–685. Identificador de objeto digital: 10.1016/j.tim.2021.01.003
  3. Pilla, R. y Suchodolski, J. S. (2021). The gut microbiome of dogs and cats, and the influence of diet. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 51(3), 605–621. Identificador de objeto digital: 10.1016/j.cvsm.2021.01.002
  4. Bokulich, N. A., Ziemski, M., Robeson, M. S. y Kaehler, B. D. (2020). Measuring the microbiome: Best practices for developing and benchmarking microbiomics methods. Computational and Structural Biotechnology Journal, 18, 4048–4062. Identificador de objeto digital: 10.1016/j.csbj.2020.11.049
  5. Radjabzadeh, D., Uitterlinden, A. G. y Kraaij, R. (2017). Microbiome measurement: Possibilities and pitfalls. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 31, 619–623. Identificador de objeto digital: 10.1016/j.bpg.2017.10.008
  6. Cusco, A., Pérez, D., Viñes, J., Fàbregas, N. y Francino, O. (2020). Long-read metagenomics retrieve complete single-contig bacterial genomes from canine feces. En revisión, BMC Genomics. Identificador de objeto digital: 10.21203/rs.3.rs-135952/v1
  7. Marchesi, J. R. y Ravel, J. (2015). The vocabulary of microbiome research: a proposal. Microbiome, 3, 31. Identificador de objeto digital: 10.1186/s40168-015-0095-5
  8. Koidl, L. y Untersmayr, E. (2021). The clinical implications of the microbiome in the development of allergy diseases. Expert Review of Clinical Immunology, 17, 115–126. Identificador de objeto digital: 10.1080/1744666X.2021.1874353