微生物组基础知识

含细菌的肠绒毛

在过去，微生物的鉴别依赖于传统培养法。此类方法存在明显的局限性，包括无法培养微生物组中的所有微生物。1-3

在与传统培养法相关的体外培养条件下，并非所有微生物均可存活。1

下一代分子法采用细菌 DNA 序列作为微生物的代替物，以确定分类标准、相对丰度和功能。1、4-6下文将简要介绍最常用的一些方法。

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测定微生物组常用方法概览

 

 

16s rRNA 基因测序
鸟枪法宏基因组测序
qPCR（包括用于评估犬类菌群失调指数的 qPCR）图示

基于扩增子的标记基因测序

最常用的方法是对在所有细菌和古生菌中存在的、但在真菌或动物界不存在的 16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因进行测序，以生成样本的微生物统计数据。1、4、7以鉴别真菌组取代 18S rRNA 基因。7

16S rRNA 基因既在不同菌种间高度保守，又包括允许分化的高变区。1该方法可鉴别样本中的许多微生物，包括无法成功培养的微生物。1但是，该技术不能区分微生物是存活还是死亡、是暂居还是常居、是共生还是致病、对抗生素是耐受还是敏感。1

定量聚合酶链反应 (qPCR)

定量 PCR 是一种快速且经济的方法，可用于量化感兴趣的特定细菌类群和制定参考范围。根据七种菌种的 qPCR，制定了犬类菌群失调指数，以跟踪治疗后微生物组的变化。3

此链接指向一篇英文文章，没有[中文]翻译

介绍“微生物统计数据”

操作分类单元 (OTU) 是基于相似度的 DNA 序列聚簇。将每个 OTU 的代表性序列与参考数据库进行比较，以指定聚簇中微生物的识别信息。

α 多样性和 β 多样性指示微生物组的种类范围。α 多样性是衡量样本内多样性的指标。1α 多样性考虑丰富度（种类/OTU 的数量及其分布）和均匀度（不同 OTU/种类的相对丰度及其分布）。α 多样性基于算法，通常以 Shannon 指数或 Simpson 指数等指数表示。1β 多样性是样本间不相似度的衡量指标，通常表示为聚簇模式。用于计算 β 多样性的系统包括 Bly-Curtis 和未加权或加权 UniFrac。1

从统计数据扩大到功能

随着研究的继续，出现两个关于微生物组的主要问题：存在哪些微生物，它们有何功能？鉴别微生物组中存在的微生物并不提供有关其功能的信息。3、5某些代谢和分子功能可能由一个以上微生物实现，其结果是形成一个冗余的生态系统，从而提供灵活性和弹性。3、8

由于这种冗余，根据菌群中存在的微生物种类进行的微生物组分析，不足以检测微生物组的功能变化。尽管微生物的相对丰度可能会或不会因干预或条件而改变，但存在的微生物组可能会改变微生物活性和代谢以进行补偿；为了检测这些变化，需要采用不同的分析方法。 

鸟枪法宏基因组测序

鸟枪法（如此命名是因为它们为非靶向方法 [不用于检测预定的微生物组的存在]）在宠物微生物组分析中越来越受欢迎。这些方法具有对功能基因进行测序的优势，而不是简单地鉴别细菌。3-5但是，这些流程需要样本中的更多 DNA，而且成本更高。3

长读测序有助于完整基因组的组装，包括通常因短读宏基因组而被遗漏的基因以及能提供额外生物学见解的基因。6

代谢组学、蛋白质组学和转录组学

这些流程测定微生物组中的功能活性。4代谢组学方法用于测定代谢物概况，通常通过核磁共振、光谱、质谱和液相色谱等流程进行表征。7这些方法研究微生物调节的途径，例如短链脂肪酸生成、胆酸代谢、神经递质生成和吲哚生成。3

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  1. Belas, A., Marques, C., & Pomba, C. (2020).The gut microbiome and antimicrobial resistance in companion animals. In Duarte, A. & Lopes da Costa, L. (Eds.), Advances in Animal Health, Medicine and Production (1st ed.), pp. 233—245. Springer International Publishing
  2. Cunningham, M., Azcarate-Peril, M. A., Barnard, A., Benoit, V., Grimaldi, R., Guyonnet, D.,…Gibson, G. R. (2021). Shaping the future of probiotics and prebiotics. Trends in Microbiology, 29(8), 667—685. doi:10.1016/j.tim.2021.01.003
  3. Pilla, R., & Suchodolski, J. S. (2021). The gut microbiome of dogs and cats, and the influence of diet. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 51(3), 605–621. doi:10.1016/j.cvsm.2021.01.002
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  6. Cusco, A., Pérez, D., Viñes, J., Fàbregas, N., & Francino, O. (2020). Long-read metagenomics retrieve complete single-contig bacterial genomes from canine feces. In review, BMC Genomics. doi:10.21203/rs.3.rs-135952/v1
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