Fundamentos do Microbioma

Fundamentos do microbioma

Historicamente, a identificação de microrganismos dependia de métodos baseados em cultura. Este método tem limitações significativas, incluindo a incapacidade de cultura de todos os organismos no microbioma.1-3

Nem todos os microrganismos são viáveis nas condições in vitro associadas a métodos baseados em cultura.1

Os métodos moleculares de última geração usam sequências de DNA bacteriano como proxies para os organismos identificarem taxonomia, abundância relativa e função.1,4-6 Os métodos mais comumente usados são descritos brevemente a seguir.

measuring the microbiomes icon

Visão geral dos métodos comumente usados para medir o microbioma

 

 

16s rRNA gene sequencing
shotgun metagenomic sequencing
qPCR (including that used for evaluating the Canine Dysbiosis Index) graphic

Sequenciamento de genes de marcadores baseados em amplicon

A abordagem mais comumente usada envolve o sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S (rRNA), presente em todas as bactérias e archaea, mas não presente em fungos ou no reino animal, para gerar um censo microbiano da amostra.1,4,7 A identificação do micobioma substitui os genes 18S rRNA.7

O gene do 16S rRNA é altamente conservado em todas as espécies bacterianas e inclui regiões hipervariáveis que permitem a diferenciação.1 Essa abordagem permite a identificação de muitos microrganismos de uma amostra, incluindo microrganismos que não podem ser cultivados com sucesso.1 No entanto, essa técnica não distingue entre microrganismos vivos ou mortos, transitórios ou residentes, comensais ou patogênicos, ou resistentes e sensíveis a antibióticos.1

Reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR)

A PCR quantitativa é um método rápido e acessível de quantificar táxons bacterianos específicos de interesse e permite o desenvolvimento de intervalos de referência. Com base na qPCR para sete espécies bacterianas, um Índice de disbiose da microbiota canina foi desenvolvido para rastrear mudanças no microbioma em resposta à terapia.3

Link para um artigo em inglês que não está disponível em português.

Descrição do "censo microbiano"

Unidades taxonômicas operacionais (Operational Taxonomic Units, OTUs) são agrupamentos das sequências de DNA com base na similaridade. Sequências representativas de cada OTU são comparadas com bancos de dados de referência para atribuir a identificação dos micróbios no cluster.

Diversidade alfa e diversidade beta indicam a faixa de espécies no microbioma. A diversidade alfa é uma medida da diversidade dentro de uma amostra.1 A diversidade alfa leva em conta a riqueza (o número de espécies/OTUs e sua distribuição) e a regularidade (a abundância relativa das diferentes OTUs/espécies e sua distribuição). A diversidade alfa é baseada em algoritmos e é comumente expressa como um índice, como o índice de Shannon ou o índice de Simpson.1 A diversidade beta é uma medida da dissimilaridade entre amostras, muitas vezes representada como padrões de cluster. Os sistemas usados para calcular a diversidade beta incluem Bray-Curtis e o UniFrac não ponderado ou ponderado.1

Expansão do censo para a função

À medida que a pesquisa continua, duas questões principais surgem em relação aos microbiomas: quais micróbios estão presentes e o que eles estão fazendo? A identificação dos microrganismos presentes no microbioma não fornece informações sobre sua função.3,5 É provável que certas funções metabólicas e moleculares sejam desempenhadas por mais de um micróbio, resultando em um ecossistema redundante para fornecer flexibilidade e resiliência.3,8

Devido a essa redundância, a análise do microbioma com base nas espécies microbianas presentes na população é insuficiente para a detecção de alterações funcionais no microbioma. Embora a abundância relativa dos micróbios possa ou não ser alterada por uma intervenção ou condição, o microbioma presente pode alterar as atividades microbianas e o metabolismo para compensar; para detectar esses deslocamentos, são necessários diferentes procedimentos analíticos. 

Sequenciamento shotgun metagenômico

Os métodos shotgun, assim chamados porque não são direcionados (não destinados a detectar a presença de um conjunto predeterminado de micróbios), estão ganhando popularidade na análise de microbioma de animais. Esses métodos oferecem a vantagem de sequenciamento de genes funcionais, em vez de simplesmente identificar a identificação bacteriana.3-5 No entanto, esses processos exigem quantidades maiores de DNA das amostras e são mais caros.3

O sequenciamento de leitura longa facilita a montagem de genomas completos, incluindo genes geralmente perdidos com metagenômica de leitura curta e que fornecem insights biológicos adicionais.6

Metabolômica, proteômica e transcriptômica

Esses processos medem a atividade funcional em um microbioma.4 Abordagens metabolômicas são utilizadas para determinar o perfil do metabólito, geralmente caracterizado através de processos como ressonância magnética nuclear, espectroscopia, espectroscopia de massa e cromatografia líquida.7 Essas abordagens investigam vias reguladas por micróbios, como produção de ácidos graxos de cadeia curta, metabolismo de ácidos biliares, produção de neutrotransmissores e produção de indol.3

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Saiba mais

  1. Belas, A., Marques, C., & Pomba, C. (2020). The gut microbiome and antimicrobial resistance in companion animals. In Duarte, A. & Lopes da Costa, L. (Eds.), Advances in Animal Health, Medicine and Production (1st ed.), pp. 233—245. Springer International Publishing
  2. Cunningham, M., Azcarate-Peril, M. A., Barnard, A., Benoit, V., Grimaldi, R., Guyonnet, D.,…Gibson, G. R. (2021). Shaping the future of probiotics and prebiotics. Trends in Microbiology, 29(8), 667—685. doi:10.1016/j.tim.2021.01.003
  3. Pilla, R., & Suchodolski, J. S. (2021). The gut microbiome of dogs and cats, and the influence of diet. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 51(3), 605–621. doi:10.1016/j.cvsm.2021.01.002
  4. Bokulich, N. A., Ziemski, M., Robeson, M. S., & Kaehler, B. D. (2020). Measuring the microbiome: Best practices for developing and benchmarking microbiomics methods. Computational and Structural Biotechnology Journal, 18, 4048–4062. doi:10.1016/j.csbj.2020.11.049
  5. Radjabzadeh, D., Uitterlinden, A. G., & Kraaij, R. (2017). Microbiome measurement: Possibilities and pitfalls. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 31, 619–623. doi:10.1016/j.bpg.2017.10.008
  6. Cusco, A., Pérez, D., Viñes, J., Fàbregas, N., & Francino, O. (2020). Long-read metagenomics retrieve complete single-contig bacterial genomes from canine feces. In review, BMC Genomics. doi:10.21203/rs.3.rs-135952/v1
  7. Marchesi, J. R. & Ravel, J. (2015). The vocabulary of microbiome research: a proposal. Microbiome, 3, 31. doi:10.1186/s40168-015-0095-5
  8. Koidl, L., & Untersmayr, E. (2021). The clinical implications of the microbiome in the development of allergy diseases. Expert Review of Clinical Immunology, 17, 115—126. doi:10.1080/1744666X.2021.1874353